Analyse der Interaktion von microRNA-122-Protein-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-untranslatierten Region der Hepatitis C Virus-RNA

Abstract

Das Hepatitis C Virus besitzt ein einzelsträngiges, positiv orientiertes RNA-Genom und ist der Familie der Flaviviridae zugeordnet. Aufgrund der positiven Orientierung kann das Genom nach der Infektion von Hepatozyten direkt dem Translationsapparat der Zelle zur Verfügung gestellt werden. Das 9600 Nukleotide umfassende Genom besitzt einen offenen Leserahmen (ORF), welcher für ein einziges Polyprotein kodiert. Nach erfolgter co- und posttranslationaler Prozessierung entstehen die reifen Genprodukte. Flankiert wird der ORF von zwei untranslatierten Regionen (UTRs), der 5´- und der 3´-UTR, welche die cis-Signale für die Translation und Replikation der viralen RNA beinhalten. Die 5´-UTR bildet eine hochkonservierte Sekundärstruktur aus, die sogenannte interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche eine cap-unabhängige Translation ermöglicht. Weiterhin besitzt die HCV-RNA verschiedene Erkennungssequenzen für die leberspezifische microRNA-122 (miR-122). Zwei dieser hochkonservierten Sequenzen befinden sich in der 5´-UTR, welche durch eine Adressierung der miR-122, gebunden an das Argonaute2-Protein (Ago2), zu einer Verstärkung der RNA-Replikation und Translation so wie zu einer Stabilisierung der RNA führt. Eine weitere miR-122-Bindungsstelle befindet sich in der variablen Region der 3´-UTR, von der berichtet wird, dass eine miR-122-Bindung keinen Einfluss auf die Translation hat. Außerdem befinden sich noch zwei hochkonservierte Erkennungssequenzen in der Nicht-Struktur-Protein 5B (NS5B)-kodierenden Region des HCV-Genoms.Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von miR-122/Ago2-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-UTR der Hepatitis C Virus-RNA. Es konnte durch co-Immunopräzipitationen gezeigt werden, dass der miR-122/Ago2-Komplex an die drei Erkennungssequenzen in der NS5B-Region und der 3´-UTR hybridisiert. Die Stärke der Bindung hängt jedoch sowohl vom verwendeten Genotypen ab, als auch davon, wie zugänglich die jeweilige Erkennungssequenz für den Komplex vorliegt. Zusätzlich konnte noch die in der Arbeitsgruppe Niepmann aufgestellte Theorie, dass eine Bindung der miR-122 an ihre seed-target-Sequenz in der 3´-UTR der HCV-RNA nur in Kombination mit einer zusätzlichen 4 Nukleotide langen Sequenz (supplemental-Region) möglich ist, widerlegt werden. Für eine Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR genügt die seed-target Sequenz. Außerdem konnte die Bindung durch das Einbringen von Mutationen in allen drei Erkennungssequenzen unterbunden werden. Des Weiteren konnte durch die Verwendung von HCV-Reporter-Konstrukten gezeigt werden, dass die Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR zu einer Reduktion der Translation führt, dies jedoch nur in Kombination mit einer miR-122-Bindung an die 5´-UTR. Diese Ergebnisse sind Voraussetzung für die weitergehende Untersuchung der Rolle dieser miR-122-Bindungsstellen im HCV-Replikationszyklus.

The Hepatitis C Virus has a positive-sense single-stranded RNA genome and belongs to the family of Flaviviridae. Due to the positive orientation of its genome, the virus RNA can be translated directly after infecting hepatocytes. The 9600 nucleotides long HCV genome contains a single open reading frame (ORF) encoding one polyprotein that is processed to yield the mature proteins. The ORF is flanked by two untranslated regions (UTRs), the 5 - and 3 -UTR, containing cis-signals for translation and replication of the viral RNA. At the 5 -end a highly structured region forms an internal ribosome entry site (IRES) for cap-independent translation initiation. Moreover, the HCV RNA has various target sequences for the liver-specific microRNA-122 (miR-122). Two highly conserved sequences are located in the 5 -UTR. Binding of miR-122 and its associated argonaute2 protein (Ago2) to these regions leads to an increase in RNA replication, translation and stabilisation. Another miR-122 binding site is located in the variable region of the 3 -UTR, which had been proposed to have no influence on HCV translation. Furthermore, two highly conserved binding sites are found in the nonstructural protein 5B (NS5B) coding region of the HCV genome.The aim of this study was the analysis of the interaction of the miR-122/Ago2 complex with the NS5B coding region as well as with the 3 -UTR of the HCV RNA. According to co-immunoprecipitation experiments, the miR-122/Ago2 complex binds to all three sites with different strength, depending on genotype and structural accessibility. Moreover, the theory by the Niepmann group that four additional nucleotides (supplemental region) are required for a correct binding of miR-122 to its seed-target sequence in the 3 -UTR is disproved. In contrast, the seed-target sequence is sufficient for the hybridisation of the miR-122/Ago2 complex to the 3 -UTR. Mutations in all three miR-122 sites resulted in the inhibition of any miR-122 binding to these regions. Furthermore, experiments with HCV reporter constructs show decreased translation efficiency caused by the hybridisation of the miR-122/Ago2 complex to the 3 -UTR only when miR-122 was additionally binding to the 5 -UTR. These results are the requirement for further experiments to examine the HCV replication cycle in full length HCV RNA experiments.