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Entwicklung eines lichtschaltbaren Restriktionsenzyms : Kontrolle der enzymatischen Aktivität mit Licht

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2009

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10138

Abstract

In dieser Arbeit konnte in Form eines proof-of-principle bewiesen werden, dass es funktionell möglich ist, die Aktivität des Restriktionsenzyms scPvuII durch chemische Modifikation mit lichtschaltbaren Azobenzol-Derivaten mit Hilfe von Licht zu regulieren. Dabei wurden insgesamt 38 Varianten von scPvuII mit Azobenzol-Derivaten modifiziert und nach einer optimierten Aufreinigung des erwünschten Modifikationsprodukts auf lichtsensitive Effekte der Aktivität hingehend untersucht. In der gewählten Photogate-Strategie konnten bisher keine größeren Licht-Schalt-Effekte erzielt werden, da es nicht gelungen ist, eine lichtschaltbare mechanische Barriere am Eingang der DNA-Bindungsstelle durch Modifikation mit mono-funktionellen Azobenzol-Derivaten zu errichten. Dagegen konnten in der Photoswitch-Strategie durch das Anbringen von bi-funktionellen Azobenzol-Schaltern insbesondere in die Region des aktiven Zentrums deutliche Aktivitätsunterschiede aufgrund spezifischer Belichtung festgestellt werden, während das Anbringen der Schalter in helikalen Regionen der DNA-Bindungsstelle wiederum nur verschwindend kleine Effekte zeigte. Der bisher beste Licht-Schalter-Effekt konnte bei zwei verschiedenen Varianten von scPvuII unabhängig voneinander durch jeweils zwei Azobenzol-Schalter im Bereich des aktiven Zentrums in Kombination mit einer die katalytische Aktivität beeinflussenden zusätzlichen Mutation gefunden werden, mit einem 16-fach höheren Aktivitätslevel in der durch UV-Licht induzierten cis-Konfiguration gegenüber der durch blaues Licht induzierten trans-Konfiguration der angehängten Azobenzol-Schalter. Es wurde gezeigt, dass die enzymatische Aktivität vollständig reversibel über mehrere Isomerisierungszyklen hinweg und zeitlich unmittelbar durch spezifische Belichtung reguliert werden konnte, dass aber die enzymatische Aktivität auch vom hohen Aktivitätslevel im cis-Zustand durch thermische Relaxation, die über die angehängten Azobenzol-Schalter vermittelt wird, in das Aktivitätslevel des trans-Zustands vollständig zurückgeführt werden kann. Der lichtabhängige Aktivitätsunterschied beruht dabei hauptsächlich auf einer direkten Beeinflussung der Katalyse (Vmax), wobei der durch die Photoisomerisierung von der cis- in die trans-Konfiguration hervorgerufene mechanische Stress aller Wahrscheinlichkeit nach einen aktiven Druck auf die Faltblattstränge im aktiven Zentrum ausübt und so zu einer Inaktivierung des Enzyms führt. Insgesamt gesehen befindet sich der in dieser Arbeit erfolgreich entwickelte Licht-Schalt-Effekt von 16 an der oberen Grenze des theoretisch Möglichen dieses Konzepts, das durch die Photochemie von Azobenzol begrenzt ist, spiegelt aber dennoch die Möglichkeit wieder, das Konzept der Photoswitch-Strategie universell auf andere Proteine übertragen zu können. Überdies bietet das generierte lichtschaltbare Restriktionsenzym durch Konjugation mit zusätzlichen DNA-Bindemodulen, wie beispielsweise Zink-Finger-Domänen, für zukünftige Applikationen das Potential, das Adressieren definierter genomischer Bereiche auf zellulärer Ebene gezielt zeitlich und räumlich kontrollieren zu können.

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