Entwicklung eines lichtschaltbaren Restriktionsenzyms : Kontrolle der enzymatischen Aktivität mit Licht

Abstract

In dieser Arbeit konnte in Form eines proof-of-principle bewiesen werden, dass es funktionell möglich ist, die Aktivität des Restriktionsenzyms scPvuII durch chemische Modifikation mit lichtschaltbaren Azobenzol-Derivaten mit Hilfe von Licht zu regulieren. Dabei wurden insgesamt 38 Varianten von scPvuII mit Azobenzol-Derivaten modifiziert und nach einer optimierten Aufreinigung des erwünschten Modifikationsprodukts auf lichtsensitive Effekte der Aktivität hingehend untersucht. In der gewählten Photogate-Strategie konnten bisher keine größeren Licht-Schalt-Effekte erzielt werden, da es nicht gelungen ist, eine lichtschaltbare mechanische Barriere am Eingang der DNA-Bindungsstelle durch Modifikation mit mono-funktionellen Azobenzol-Derivaten zu errichten. Dagegen konnten in der Photoswitch-Strategie durch das Anbringen von bi-funktionellen Azobenzol-Schaltern insbesondere in die Region des aktiven Zentrums deutliche Aktivitätsunterschiede aufgrund spezifischer Belichtung festgestellt werden, während das Anbringen der Schalter in helikalen Regionen der DNA-Bindungsstelle wiederum nur verschwindend kleine Effekte zeigte. Der bisher beste Licht-Schalter-Effekt konnte bei zwei verschiedenen Varianten von scPvuII unabhängig voneinander durch jeweils zwei Azobenzol-Schalter im Bereich des aktiven Zentrums in Kombination mit einer die katalytische Aktivität beeinflussenden zusätzlichen Mutation gefunden werden, mit einem 16-fach höheren Aktivitätslevel in der durch UV-Licht induzierten cis-Konfiguration gegenüber der durch blaues Licht induzierten trans-Konfiguration der angehängten Azobenzol-Schalter. Es wurde gezeigt, dass die enzymatische Aktivität vollständig reversibel über mehrere Isomerisierungszyklen hinweg und zeitlich unmittelbar durch spezifische Belichtung reguliert werden konnte, dass aber die enzymatische Aktivität auch vom hohen Aktivitätslevel im cis-Zustand durch thermische Relaxation, die über die angehängten Azobenzol-Schalter vermittelt wird, in das Aktivitätslevel des trans-Zustands vollständig zurückgeführt werden kann. Der lichtabhängige Aktivitätsunterschied beruht dabei hauptsächlich auf einer direkten Beeinflussung der Katalyse (Vmax), wobei der durch die Photoisomerisierung von der cis- in die trans-Konfiguration hervorgerufene mechanische Stress aller Wahrscheinlichkeit nach einen aktiven Druck auf die Faltblattstränge im aktiven Zentrum ausübt und so zu einer Inaktivierung des Enzyms führt. Insgesamt gesehen befindet sich der in dieser Arbeit erfolgreich entwickelte Licht-Schalt-Effekt von 16 an der oberen Grenze des theoretisch Möglichen dieses Konzepts, das durch die Photochemie von Azobenzol begrenzt ist, spiegelt aber dennoch die Möglichkeit wieder, das Konzept der Photoswitch-Strategie universell auf andere Proteine übertragen zu können. Überdies bietet das generierte lichtschaltbare Restriktionsenzym durch Konjugation mit zusätzlichen DNA-Bindemodulen, wie beispielsweise Zink-Finger-Domänen, für zukünftige Applikationen das Potential, das Adressieren definierter genomischer Bereiche auf zellulärer Ebene gezielt zeitlich und räumlich kontrollieren zu können.

In this thesis, it could be demonstrated as proof-of-principle , that it is functionally possible to regulate the activity of the restriction enzyme scPvuII, chemically modified with light-switchable azobenzene derivatives, via specific illumination. All together, 38 variants of scPvuII were modified with azobenzene derivatives and screened for a light-sensitive effect. To this end the purification procedure had first to be optimized in order to obtain the desired modified protein species. One strategy used, the so called photogate strategy, which aimed at inserting a light-switchable mechanical barrier at the entrance of the DNA binding site through modification with mono-functional azobenzene derivatives, so far appeared not to be successful as no major light-switch effects could be detected. In contrast, the photoswitch strategy is based on the insertion of bi-functional azobenzene switches. If introduced in the region of the active center, this resulted in pronounced changes in the activity upon specific illumination. However, if the switches were positioned in the helical regions of the DNA binding site only slight effects were observed. The best light-switch effect obtained so far made used of two azobenzene switches in the region of the active center in a variant having an additional mutation which affects catalysis. Two individually designed lightswitchable scPvuII variants - having this feature - had a 16-fold increased activity in the UV light induced cis-configuration compared to the blue light induced trans-configuration of the inserted azobenzene switches. It was shown that the enzymatic activity could be controlled in a fully reversible manner with an immediate response over several cycles of photoisomerization through specific irradiation. Additionally, the enzymatic activity of the high activity level in the cis-state could be completely traced back to the activity level of the trans-state via thermal relaxation, which is mediated by the inserted azobenzene moiety. The light-dependent difference in activity relies mainly on a direct influence on catalysis (Vmax), whereas the mechanical stress that is induced by the photoisomerization from the cis- to the trans-state very probably leads to an active pressure on the beta-sheets of the active site, thus inactivating the enzyme. All in all, the successfully developed light-switch effect of 16 , whose extent seems to be limited by the photochemistry of azobenzene, reflects the possibility, that the photoswitch concept could be transferred to other proteins in a universal manner. Furthermore, the conjugation of the generated light-switchable restriction enzyme with additional DNA binding modules, e.g. zinc-finger domains, in future applications might provide the potential to control gene targeting in a spatially and also temporally precise way.