Funktionelle Charakterisierung der pestiviralen Ribonuklease E rns
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Zusammenfassung
Die T2 Ribonuklease Erns ist ein Glykoprotein, das ausschließlich bei Pestiviren vorkommt. Es tritt sowohl als Strukturprotein als auch als sezerniertes Protein in Erscheinung. Während E rns für die Bildung von Viruspartikeln als essentiell beschrieben wurde, ist die Funktion der RNase für den viralen Lebenszyklus sowie die Pathogenese unbekannt. Um die Enzymfunktion von Erns zu analysieren, wurden drei experimentelle Ansätze gewählt: 1. Bestimmung der Substratspezifität, 2. Mutationsanalyse des aktiven Zentrums inklusive Modellierung des Proteins und 3. Einfluss von N-Glykosylierung auf die Enzymaktivität. zu 1 Die Spaltspezifität von Erns wurde auf der Grundlage von heteropolymeren RNA-Substraten in limitierenden Verdauen ermittelt. RNA-Fragmente, die nach limitierenden Verdauen durch Erns gebildet wurden, entsprechen einer Spaltung 5´ von Uridin (NpU). Für die Untersuchung der NpU Spaltstelle wurden einzelsträngige RNA-Moleküle (45-56 nt) eingesetzt, die sich nur an der N-Position unterscheiden (N= A, C, G oder U). Kinetische Bestimmungen der NpU Spaltung durch E rns ergaben Affinitätskonstanten zwischen 105 250 nM sowie einen geringen Substratumsatz von weniger als einem Molekül Substrat/ Molekül Enzym s-1. zu 2 Auf der Grundlage der Substratspezifität wurde ein RNase-Test für die Aktivitätsbestimmung von Erns-Mutanten entwickelt. Neben insgesamt 14 Mutationen im Bereich des aktiven Zentrums, die im Wesentlichen die Zugehörigkeit zur T2 RNase Familie bestätigten, wurden auch C-terminale Verkürzungen untersucht. Nach Verkürzung des C-Terminus um 87 Aminosäuren blieb die RNase-Aktivität des Erns erhalten. Dieses Ergebnis ist in Analogie zu einem Modell von Erns, das auf der Grundlage von RNase Rh erstellt wurde. Auch das Modell lässt die Eigenständigkeit einer RNase-Domäne erkennen, die etwa die N-terminale Hälfte des Proteins umfasst (aa 1-103). zu 3 Die Anheftung von Zuckermolekülen an die Asparaginreste der N-Glykosylierungsstellen wird durch die Substitution von Asn durch Gln verhindert. Nach Substitution einzelner bzw. mehrerer Asparagine wurden insgesamt 38 Erns-Mutanten erzeugt, und die Aktivitäten nach Expression in eukaryonten Zellen bestimmt. Während in Abwesenheit aller N-Glykosylierungsstellen keine RNase-Aktivität mehr nachgewiesen wurde, ist das Vorkommen von zwei N-Glykosylierungsstellen, NGS 1 und 5, für den Erhalt der enzymatischen Aktivität ausreichend. Die gleichen N-Glykosylierungsstellen sind auch für die Vermehrungsfähigkeit von KSPV in revers genetischen Experimenten essentiell.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2003