Funktionelle Charakterisierung der pestiviralen Ribonuklease E rns

Abstract

Die T2 Ribonuklease E^rns ist ein Glykoprotein, das ausschließlich bei Pestiviren vorkommt. Es tritt sowohl als Strukturprotein als auch als sezerniertes Protein in Erscheinung. Während E ^rns für die Bildung von Viruspartikeln als essentiell beschrieben wurde, ist die Funktion der RNase für den viralen Lebenszyklus sowie die Pathogenese unbekannt. Um die Enzymfunktion von E^rns zu analysieren, wurden drei experimentelle Ansätze gewählt: 1. Bestimmung der Substratspezifität, 2. Mutationsanalyse des aktiven Zentrums inklusive Modellierung des Proteins und 3. Einfluss von N-Glykosylierung auf die Enzymaktivität.

zu 1 Die Spaltspezifität von E^rns wurde auf der Grundlage von heteropolymeren RNA-Substraten in limitierenden Verdauen ermittelt. RNA-Fragmente, die nach limitierenden Verdauen durch E^rns gebildet wurden, entsprechen einer Spaltung 5´ von Uridin (NpU). Für die Untersuchung der NpU Spaltstelle wurden einzelsträngige RNA-Moleküle (45-56 nt) eingesetzt, die sich nur an der N-Position unterscheiden (N= A, C, G oder U). Kinetische Bestimmungen der NpU Spaltung durch E ^rns ergaben Affinitätskonstanten zwischen 105 250 nM sowie einen geringen Substratumsatz von weniger als einem Molekül Substrat/ Molekül Enzym s-1.

zu 2 Auf der Grundlage der Substratspezifität wurde ein RNase-Test für die Aktivitätsbestimmung von Erns-Mutanten entwickelt. Neben insgesamt 14 Mutationen im Bereich des aktiven Zentrums, die im Wesentlichen die Zugehörigkeit zur T2 RNase Familie bestätigten, wurden auch C-terminale Verkürzungen untersucht. Nach Verkürzung des C-Terminus um 87 Aminosäuren blieb die RNase-Aktivität des Erns erhalten. Dieses Ergebnis ist in Analogie zu einem Modell von E^rns, das auf der Grundlage von RNase Rh erstellt wurde. Auch das Modell lässt die Eigenständigkeit einer RNase-Domäne erkennen, die etwa die N-terminale Hälfte des Proteins umfasst (aa 1-103).

zu 3 Die Anheftung von Zuckermolekülen an die Asparaginreste der N-Glykosylierungsstellen wird durch die Substitution von Asn durch Gln verhindert. Nach Substitution einzelner bzw. mehrerer Asparagine wurden insgesamt 38 Erns-Mutanten erzeugt, und die Aktivitäten nach Expression in eukaryonten Zellen bestimmt. Während in Abwesenheit aller N-Glykosylierungsstellen keine RNase-Aktivität mehr nachgewiesen wurde, ist das Vorkommen von zwei N-Glykosylierungsstellen, NGS 1 und 5, für den Erhalt der enzymatischen Aktivität ausreichend. Die gleichen N-Glykosylierungsstellen sind auch für die Vermehrungsfähigkeit von KSPV in revers genetischen Experimenten essentiell.

The T2 Ribonuclease E^rns is a glycoprotein, which is only present in pestiviruses. E^rns is a structural protein and it is also secreted from infected cells. While it is described that E^rns is essential for the formation of viral particles, the function of the RNase-activity for the viral lifecycle or pathogenesis is unknown. To analyze the enzymatic function of E^rns, three different experimental approaches were chosen: 1st determination of the substrate specificity, 2nd mutagenesis-studies with respect to the active site including modeling of E^rns and 3rd influence of N-glycosylation on enzyme activity.

1st To detect the cleavage specificity of E^rns a limited digest of heteropolymeric RNA-substrates was performed. Under suboptimal conditions E^rns cleaves exclusivly phosphodiesterbonds 5´ of uridine bases (NpU). To analyze the NpU cleavage site, single stranded RNA molecules of 45-56 nts were synthesized. These substrates only differ in the base at the N-position (N= A, C, G oder U). Kinetic parameters of the NpU cleavage for all four substrates revealed Km values of 105 250 nM and a low turn over rate (less than one molecule substrate/ molecule enzyme s-1).

2nd Based on the substrate specificity an RNase-assay was established, which allowed the precise determination of the RNase-activity of various E^rns-mutants. The results of 14 mutants with single amino acid exchanges in the active center mainly conformed the integration of E^rns into the family of T2 RNases. In addition E^rns was C-terminal truncated and the Rnase-activity was measured. The deletion of 87 C-terminal amino acids still led to an active RNase. These results conformed a model of E^rns, which was designed based on the crystal structure of the T2 RNase Rh. According to the 3-D structure the N-terminal half of the protein forms an independent RNase domain (aa 1-103).

3rd Asn to Gln substitution abolishes the linkage of sugar molecules to the asparagine residue of N-glycosylation sites. Substitution of single, double or multiple asparagine residues resulted in 38 E^rns-mutants. The E^rns-mutants were expressed in eucaryotic cells and the RNase activity was analyzed. While the deletion of all N-glycosylation sites led to an inactive enzyme, a minimal set of two N-glycosylation sites, NGS 1 and 5, turned out to be sufficient for RNase activity. In a reverse genetic system the same minimal set was also essential for the detection of CSFV.