Thrombozyten der Equiden - ein unterschätzter Biomarker?

Abstract

Erst mit Beginn dieses Jahrhunderts wurde deutlich, dass Thrombozyten neben ihrer essentiellen Bedeutung für die Blutgerinnung eine substantielle Rolle im Rahmen von Entzündungen spielen. So war es naheliegend, Untersuchungen zu Thrombozytenzahlen und -variablen sowie der Thrombozytenfunktion bei gesunden und kranken equinen Individuen durchzuführen. Da bei humanen Patienten positive Einflüsse einer Hemmung der Thrombozytenfunktion auf eine reduzierte Thromboseneigung und den Erkrankungsverlauf von SIRS-Patienten ermittelt werden konnten, sollte zudem die Möglichkeit der oralen medikamentösen Hemmung der Thrombozytenfunktion beim Pferd überprüft werden.Das Hämatologiegerät ADVIA® 2120 ist eine Standardmethode in der Messung von Thrombozytenzahlen sowie deren Variablen. Die eigenen Untersuchungen konnten jedoch zeigen, dass equine Thrombozyten durch die etablierten Antikoagulantien K3-EDTA und Zitrat nicht ausreichend aufgekugelt werden und die Messergebnisse insbesondere der Variablen MPV und MPC hierdurch beeinflusst sein können. In künftigen Studien könnte überprüft werden, ob durch Verwendung anderer Antikoagulantien wie dem CTAD (Citrate, Theophylline, Adenosine and Dipyridamole) validere Messergebnisse erreicht werden könnten.Die Etablierung von Referenzintervallen auf Basis einer klinisch unauffälligen Referenzpopulation ist in der Labordiagnostik oftmals ein logistisches und finanzielles Problem. Dies wird noch verstärkt, wenn wie in der vorliegenden Untersuchung für den ADVIA® 2120 und den Multiplate® Analyzer innerhalb einer Spezies zum Teil klinisch relevante rasseabhängige Unterschiede ermittelt werden können. Hier könnten statistische Verfahren aus der Humanmedizin, im Rahmen derer Referenzintervalle anhand aller in einem Labor vorhandenen Daten geschätzt werden, auch für die Veterinärmedizin ein sinnvolles Werkzeug darstellen.Thrombozytopenien und Thrombozytosen treten beim Pferd mit einer Prävalenz von 3,4 % bzw. 3,1 % im Vergleich mit anderen Spezies deutlich seltener auf. Da es sich in der vorliegenden Untersuchung um ein bereits vorselektiertes Patientenmaterial handelt, ist anzunehmen, dass die Prävalenz in der gesamten Pferdepopulation deutlich geringer ist. In Verbindung mit systemischen Entzündungen sowie Neoplasien sind die Abweichungen in der Thrombozytenzahl negativ prognostisch, wobei der Schweregrad keine Rückschlüsse auf das Überleben zulässt.Erstmals konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Prävalenz einer EDTA-induzierten Pseudothrombozytopenie beim Equiden bis zu 5 % beträgt. Sie sollte insbesondere bei einer Thrombozytopenie ohne klinische Anzeichen einer Blutungsneigung als Ursache in Betracht gezogen werden. Gleiches gilt für das Auftreten von > 250 Clumps (Thrombozytenaggregate) in Messungen mit dem ADVIA® 2120. Verifizieren lässt sich die EDTA-PTCP durch eine Messung aus mit Zitrat antikoagulierten Blut innerhalb von 4 bis 6 Stunden nach Blutentnahme.Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal, beim Equiden aus Thrombozyten-Leukozyten-reichem Plasma aktivierte Thrombozyten sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten mittels Fluoreszenz-Durchflusszytometrie unter Verwendung zweier geringfügig modifizierter humaner Protokolle nachzuweisen. Zudem konnte erstmals gezeigt werden, dass bei Aktivierung der Thrombozyten auch beim Pferd eine Exprimierung von CD154 (CD40L) stattfindet. Der Nachweis RNA-reicher Thrombozyten gelang auf diesem Wege jedoch nicht. Desgleichen konnten bei Pferden mit 2 humanen ELISAs lösliche Formen der Glykoproteine CD40L und CD62P im Serum nicht nachgewiesen werden.Eine Zunahme von Thrombozytenaktivierung und der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate konnte darüber hinaus erstmalig bei equinen Patienten mit SIRS gezeigt werden. Mittels Impedanzaggregometrie am Multiplate® Analyzer konnten jedoch bei diesen Patienten keine signifikanten Unterschiede der Thrombozytenfunktion ermittelt werden. Dies ist mutmaßlich darauf zurückzuführen, dass die Impedanzaggregometrie im Vollblut erheblich vom Schweregrad der Erkrankung beeinflusst ist. Während bei leichter erkrankten Patienten eine Erhöhung der Aggregationswerte erwartet werden kann, gilt für schwer erkrankte Patienten das Gegenteil. Da in der eigenen Untersuchung sehr wahrscheinlich alle Schweregrade einer SIRS vertreten waren, hoben sich die folglich entgegengesetzt auftretenden Aggregationen in der Summe mutmaßlich auf.Im Rahmen der Untersuchungen konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass niedrige Thrombozytenzahlen bei equinen SIRS-Patienten mit einer erhöhten Mortalität assoziiert sind. Darüber hinaus ergaben sich Hinweise, dass niedrige Aggregationswerte des COLtest, ADPtest und ADPtestHS am Multiplate® Analyzer sowie eine Erhöhung der prozentualen Anteile aktivierter Thrombozyten sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate ebenfalls mit einer erhöhten Mortalität assoziiert sein könnten.Thrombozytenzahl, Thrombozytenaggregation, Thrombozytenaktivierung sowie Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate könnten somit auch beim Pferd aussagekräftige Variablen in diagnostischen Algorithmen zur Prognose bei SIRS-Patienten darstellen.Bei klinisch unauffälligen Warmblütern konnte durch die orale Gabe von Clopidogrel in einer einmaligen Anfangsdosis von 6-6,5 mg/kg sowie einer täglichen Erhaltungsdosis von 1,2-1,4 mg/kg sowohl die ADP-induzierte als auch die Arachidonsäure-induzierte Aggregation gehemmt werden. Die orale Verabreichung von Acetylsalicylsäure verursachte in der gleichen Pferdegruppe lediglich eine mäßige Hemmung der Arachidonsäure-induzierten Aggregation. Zudem konnte eine dauerhafte Hemmung nicht erreicht werden. Bei 3 der 10 Pferde konnte darüber hinaus eine Aspirin-Resistenz vermutet werden. So erscheint im Gegensatz zu Clopidogrel der Nutzen der ASS für einen Einsatz in der Thromboseprophylaxe und -therapie beim Pferd aufgrund des mutmaßlich eher geringen hemmenden Effektes fraglich.Es bleibt in weiteren Untersuchungen zu überprüfen, ob sich durch die orale Gabe von Clopidogrel die im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesenen Reaktionen insbesondere der Thrombozytenaktivierung und der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate bei equinen SIRS-Patienten beeinflussen lassen und ob hierdurch der Krankheitsverlauf positiv beeinflusst werden kann. It was not until the early 21st century that it became clear that, in addition to their primary role in hemostasis, platelets are multifunctional and act as key players in inflammatory processes. It therefore seemed apposite to investigate platelet biology in healthy and diseased horses. Since it had been demonstrated that inhibition of platelet function reduces the mortality of severe disease in human ICU patients, a further purpose of the studies was to determine the efficacy of oral antiplatelet drugs in horses.The ADVIA® 2120 automated hematology system is a standard method of measuring platelet numbers and variables in veterinary laboratory diagnostics. However, the results of the own study demonstrated that adequate sphering due to the established anti-coagulants K3-EDTA and citrate was not archived in equine platelets and that this phenomenon may influence measurement results, in particular the variables MPC and MPV. Further studies are required to investigate whether the use of other anticoagulants as CTAD (citrate, theophylline, adenosine and dipyridamole) could provide more valid results for the measurement of the platelet variables.The establishment of reference intervals based on a healthy clinical reference population often represents a logistical and financial challenge in laboratory diagnostics. This situation is further complicated by the fact that in the present study clinically relevant breed-related differences were determined for the ADVIA® 2120 and the Multiplate® Analyzer measurements. Statistical methods used in human medicine in which reference intervals are estimated on the basis of all the data available in a laboratory can probably pose an option as valuable tool in veterinary medicine too.The prevalence of thrombocytopenia and thrombocytosis determined in a German referral equine internal medicine center was, at levels of 3.4 % and 3.1 % respectively, lower than in other species. Given that a referral clinic population is subject to preselection, it seems extremely probable that the prevalence in the whole population is even lower. Although both thrombocytopenia and thrombocytosis are correlated with a negative outcome in horses with systemic inflammatory conditions and neoplastic disorders, survival is not impacted by the extent of the variation.For the first time, the present study demonstrated a prevalence of up to 5 % for the EDTA-induced pseudothrombocytopenia in equids. This in vitro phenomenon should be considered especially in patients with no clinical signs of an increased bleeding tendency and a thrombocytopenia or more than 250 clumps (platelet aggregates) measured with the ADVIA® 2120. The EDTA-PTCP may be verified by platelet counting in citrated blood samples within 4-6 hours after sampling.This is the first study to measure equine activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates in platelet-rich-plasma with flow-cytometry using modified human protocols. It is also the first study to demonstrate that CD40L is expressed in equine platelets during activation. Measurement of juvenile, immature, RNA-rich platelets using this method nevertheless failed. Similarly, a soluble form of glycoproteins CD40L and CD62P could not be quantified in equine plasma samples using commercial human ELISAs.Moreover, for the first time the study identified increased numbers of activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates in clinical cases of equine SIRS. Measurement of whole blood impedance aggregometry with the Multiplate® Analyzer failed to verify differences in these patients compared to healthy controls. This could be explained by the fact that whole blood impedance aggregometry is mainly influenced by the severity of disease. In less severe cases platelet aggregation is usually increased, whereas in severe cases the opposite reaction occurs. As the equids included in the SIRS group probably exhibited all the degrees of disease severity, it is probable that the higher and lower aggregations were offset on balance in the final count.As far as the survival of equids with SIRS is concerned, the study for the first time reveals a correlation between low platelet counts and increased mortality. Furthermore, there were indications of increased mortality in patients with decreased aggregations of the COLtest, ADPtest and ADPtestHS on the Multiplate® Analyzer and increased numbers of activated platelets and platelet-leukocyte-aggregates.Platelet count, platelet aggregation, platelet activation and platelet-leukocyte-aggregates may therefore represent valuable variables in diagnostic and prognostic algorithms in equine SIRS.Oral clopidogrel with a loading dose of 6-6.5 mg/kg and daily maintenance doses of 1.2-1.4 mg/kg induced an inhibition of ADP- and arachidonic acid-induced platelet function in healthy horses. Oral administration of acetylsalicylic acid (aspirin) in the same group of horses only led to a moderate inhibition of the arachidonic acid-induced platelet function. An aspirin resistance was suspected in three horses. In view of its presumably low inhibitory effects in contrast to clopidogrel, the efficacy of aspirin in preventing and treating thrombotic diseases in horses appears doubtful.Further studies are accordingly required to evaluate the efficacy of clopidogrel as a platelet inhibitor in equine SIRS and to evaluate the potentially positive impact of platelet inhibition on survival.