Das Ziel dieser Arbeit war es, die natürliche Bildung eines neuen Restriktions-Modifikationssystem anhand des Beispiels der als nicht klonierbar geltenden S176N Mutante des Restiktionsenzyms R.HgiBI nachzuahmen. Die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante sollte dabei entweder durch eine neue Spezifität oder durch eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Aktivität hervorgerufen werden, die nicht mehr durch die Methyltransferase M.HgiBI abgedeckt wird.Als Untersuchungsobjekt boten sich die drei sehr nahe miteinander verwandten RM-Systeme RM.HgiBI. RM.HgiCII und RM.HgiEI an. In Gegenwart verschiedener Varianten der Methyltransferase M.HgiBI gelang es, die gesuchte S176N auch für R.HgiBI herzustellen. Ferner gelang es dieselbe vorher nicht erhaltene Mutante herzustellen, wenn neben einer der beiden Methyltransferasen M.HgiBI oder M.HgiEI auch noch ein kleiner offener Leserahmen (orfC) aus den RM-Operon anwesend war. Dieser sog. control orfC wurde bisher nur bei der Klonierung von R.HgiEI und R.HgiCII benötigt. Es wird daher spekuliert, dass dieser OrfC die Expressionsrate der Methyltransferasen positiv beeinflusst.Sowohl die Spezifität als auch die Aktivität der Methyltransferasen konnte durch die intensive Nutzung der DNA-Sequenzierung nach Bisulfit-Behandlung aufgeklärt werden. Während sowohl M.HgiBI als auch M.HgiEI neben der Haupterkennungssequenz GGWCC auch die verwandte Sequenz GGSCC methyliert, während die dritte Methyltransferase M.HgiCII diese Aktivität nicht zeigt. Umgekehrt ist M.HgiCII aber deutlich aktiver in der Methylierung der Hauptsequenz GGWCC. Schließlich wurden die drei Endonuklease mit einer speziell entwickelten Strategie darauf untersucht, ob sie neben der Haupterkennungssequenz auch andere Sequenzen erkennen. Die Verwendung eines sehr bequemen Expressionsassays für das grün fluoreszierende Protein GFP ließ schnell erkennen, dass die beiden Endonukleasen R.HgiCII und R.HgiEI keinerlei zusätzliche Spezifitäten besitzen. Nur R.HgiBI zeigt eine zusätzliche Aktivität, bei der die Sequenz GAACC spezifisch geschnitten wird. Durch Zufall wurde das Gen für die Methyltransferase M.HgiBI in zwei Proteine aufgeteilt. Während die Fähigkeit die Sequenz GGSCC zu methylieren verloren ging, konnte nun die bei der zugehörigen Endonuklease gefundene Sequenz GAACC methyliert werden. Die bis dato nicht erhaltene Mutante R.HgiBI S176N konnte in vier Fällen hergestellt werden. Es stellte sich heraus, dass deren Klonierung nur mit starken Methyltransferase-Varianten möglich ist. Das beweist, dass die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante auf der Stärke der Endonuklease beruht.
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