Dissertationen/Habilitationen

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2,2´-Methylenverbrückte Bispiperidine : Darstellung und Eigenschaften neuartiger Ligandensysteme
(2008) Grasemann, Franka
Die Arbeit beschreibt Synthesewege zu 2,2 -Methylenverbrückten Piperidinen sowie die Trennung der anfallenden Stereoisomeren und die Darstellung verschiedener Derivate dieser Verbindungsklasse. Mit dem Einsatz als neuartige Liganden sowie der möglichen Verwendung als beta-turn-Peptidomimetika werden mögliche Anwendungen dieser Verbindungsklassen beschrieben.
3-Chlorpiperidine als Reagenzien zur Spaltung von DNA
(2008) Roesmann, Rolf
Eines der wichtigsten Ziele der Pharmaforschung des 21. Jahrhunderts ist die Entwicklung neuer, effizienter Wirkstoffe für die Tumortherapie. Viele der dabei verfolgten Ansätze basieren auf Wirkmechanismen, bei denen DNA gezielt geschädigt wird, was zum Absterben des Tumors führt. So alkyliert der bekannte Wirkstoff Azinomycin A DNA, was zu einem Doppelstrangbruch führt. Auch die Verbindung 593A zeigt Wirksamkeit gegen Tumore. Vermutlich basieren beide Wirkstoffe auf ähnlichen Mechanismen, der Alkylierung von DNA durch die vorhandenen elektrophilen Zentren.In der Arbeitsgruppe Göttlich wurde gefunden, dass auch einfache 3-Chlorpiperidine einen Einzelstrangbruch von DNA generieren, vermutlich ebenfalls über eine Alkylierung der DNA durch ein intermediär gebildetes Aziridiniumion. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Reaktivitäten von 3-Chlorpiperidinen genauer untersucht, wobei die erhaltenen Ergebnisse genutzt wurden, um gezielt 3-Chlorpiperidine mit einer hohen Reaktivität gegenüber DNA herzustellen, insbesondere solche Verbindungen welche zwei 3-Chlorpiperidine als elektrophile Zentren in unterschiedlichen Abständen enthalten. Als Leitstruktur für diesen benötigten optimalen Abstand der elektrophilen Zentren, zur Generierung einer Quervernetzung von DNA, wurde die schon oben beschriebene Azinomycin A Struktur als Model genutzt. Die in dieser Arbeit auf einem neuartigen Weg der Iodid-katalysierten Cyclisierung von ungesättigen bis-N-Chloraminen synthetisierten bis-3-Chlorpiperidine wurden in einem nächsten Schritt in Zusammenarbeit mit dem Biochemischen Institut der JLU-Giessen auf ihre Quervernetzungsaktivitäten von DNA an Plasmiden getestet. Besonders hohe Aktivitäten für die Erzeugung eines Doppelstrangbruchs zeigten die aliphatisch verbrückten bis-3-Chlorpiperidin Systeme mit einem Abstand von 5-6 Kohlenstoffen zwischen den beiden elektrophilen 3-Chlorpiperidin Zentren. Die dargestellten esterverbrückten bis-Elektrophile zeigten ebenfalls eine hohe Quervernetzungsrate und selbst starre aromatische Spacer sowie über Cyclohexan verbrückte bis-3-Chlorpiperidine generieren einen Doppelstrangbruch vonder DNA. Neben der Entwicklung einer neuartigen Synthesemethode für die Darstellung von bis-3-Chlorpiperidine wurden in dieser Arbeit erste komplexere asymmetrische polyhydroxylierte 3-Chlorpiperidine dargestellt. In zukünftigen Arbeiten sollten diese Ausgangsverbindungen nicht nur zu einer effektiveren Quervernetzungsrate von DNA führen sondern sie könnten auch als Leitstruktur für die Synthese von Azazuckern wie das N-Butyldeoxynojirimycin genutzt werden.
A twostep affinity purification of nuclear mRNPs
(2020) Wierschem, Christoph
Die Genexpression ist ein hochkomplexer und streng regulierter Prozess, bei dem die Boten-RNA (mRNA) vom Zellkern ins Zytoplasma transportiert und dort übersetzt wird. Ein wichtiger Schritt der Genexpression ist die Bildung eines Komplexes aus einer mRNA und vielen Proteinen , welcher mRNP genannt wird. Ein in S. cerevisiae konservierter Proteinkomplex TREX ist neben der Synthese und dem Export von mRNA auch an der Bildung dieser mRNPs beteiligt. Obwohl in Hefe viele RNA bindende Proteine (RBPs) untersucht sind, ist die Zusammensetzung und die Struktur der nuklearen mRNPs bis heute unbekannt. Da beim Menschen einige Arten von Krebs und neurologische Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ihren Ursprung in der Fehlregulation von Proteinen haben, welche an der mRNP Formation beteiligt sind, ist es essenziell, den Prozess der mRNP Formation in Hefe zu studieren und dieses Wissen auf die menschliche Genexpression zu übertragen. Zur Untersuchung der mRNP Formation in Hefe stellt diese Studie ein Reinigungsprotokoll für nukleare mRNPs vor. Das Ziel ist die Reinigung eines spezifischen nuklearen mRNP. Das Wort spezifisch beschreibt, dass nur Kopien eines mRNPs von einer zuvor ausgewählten mRNA aus dem Zellextrakt gereinigt werden. Im ersten Schritt werden alle nuklearen mRNPs über eine Affinitätsreinigung angereichert. Dies geschieht über die Selektion nach der 5‘ Kappe der mRNAs. Im nächsten Schritt wird die mRNA von CCW12 oder ILV5, deren mRNPs gereinigt werden sollen, durch einen biotinylierten 2'-O methylierten Antisense-Oligonukleotid erkannt und gebunden. Zur Verbesserung der Reinigung wurden unterschiedliche Inkubationszeiten und Temperaturen, sowie verschiedene Puffer getestet. Um die Auswirkung der Änderung auf die Reinigung zu untersuchen, wurden die mRNA Level mit qPCR bestimmt und die aufgereinigten Proteine auf Western Blot analysiert. Des Weiteren wurden die gereinigten mRNP Komplexe unter dem Elektronen Mikroskop (EM) untersucht. Es wurden Partikel gefunden, die in Form und Größe den Voraussagen für CCW12 mRNPs in der Literatur entsprechen. Das hier veröffentlichte Protokoll kann zur Reinigung jedes spezifischen nuklearen mRNP verwendet werden. Die gereinigten Proben dienen der weiteren Charakterisierung des mRNP. Dazu zählen unter anderem die Bestimmung der Masse, der Struktur und die Ladung des Komplexes. Das Verständnis der mRNP Formation und das Wissen über jeden Zustand des Komplexes während seien Lebens-Zyklus liefert möglicherweise Antworten auf die Frage, warum Proteine, die für die mRNP Formation beim Menschen verantwortlich sind, zur Ausprägung diverser Krebsarten und neurologischer Krankheiten beitragen.
Accurate Coupled Cluster Energies via Machine Learning: Delta Learning Extrapolated from Wavefunction and Density-Functional Theory
(2023) Ruth, Marcel
The absolute energies of molecules are essential in many areas, such as atmospheric chemistry, thermochemistry, kinetics, catalysis, reaction predictions, and the study of reactive intermediates. Traditionally, energies were determined through elaborate quantum mechanical computations. Depending on the size of the molecule, only computations at a low level of theory can be carried out, such as methods based on density functional theory. Small molecules can be calculated using a wave function based method, like the coupled cluster theory, often referred to as the gold standard of computational chemistry, especially when the CCSD(T)/cc-pVTZ theory level is used. With the exponential development of the computing power of special accelerator cards (graphics cards), machine learning has experienced a real upswing and is often found in the everyday language under the buzzword "artificial intelligence". In this work, two methods were developed to predict accurate molecular energies of molecules using statistical models. Starting from a lower theory level, which requires significantly less computing power, the models were able to predict the differences in energies to the higher theory level. Such an approach is known as Delta-Learning. This not only saves time but also enables the prediction of energies for large molecules, which could not be calculated quantum mechanically. In the first publication, a database of 540 molecules was generated using the CCSD(T) method to train a model that can predict from the CCSD method to the CCSD(T) method and has an accuracy of 0.25 kcal mol–1. The subsequent work achieved with a database size of 8000 molecules the prediction of the CCSD(T)/cc-pVTZ energy based on density functional based properties with a mean absolute error of <1 kcal mol–1 with twentyfold time saving.
Activation of small molecules with iron(II)- and copper(I)-complexes
(2021-07-01) Specht, Pascal
The studies on the reactivity of dioxygen and nitrogen monoxide with transition metal model complexes provide important insights for a better understanding of similar processes in biological environments. Due to its short-lived nature in the human body the physiological significance of nitrogen monoxide compared to dioxygen has only been known for a relatively short time. Accordingly, there are still many unanswered questions regarding the reaction mechanisms of nitrogen monoxide in biological processes, as well as its potential as a drug and for treating various diseases. Dioxygen, on the other hand, is already well studied due to its importance as an oxidizing and oxygenating agent in the human body. Therefore, the focus is to mimic the reactivities of enzymes by model systems to perform selective and catalytic/stoichiometric oxygenation reactions under mild reaction conditions in the laboratory or for an application in industry. During this research, various iron complexes were kinetically investigated for their reactivity towards nitrogen monoxide in methanol using low temperature stopped-flow technique to gain a better understanding of the mechanisms of such reactions. The used systems had different complex coordination environments, starting with the "simple" iron(II) chloride, via the mononuclear complex iron-bztpen to the dinuclear iron-HPTB. It was shown that in the MNIC/DNIC system the reaction to the mononitrosyl complex (MNIC) is, as expected, very fast, independent of the nitrogen monoxide concentration and proceeds via a dissociative interchange mechanism. The further reaction to the dinitrosyl complex (DNIC) proceeds very slowly, also in comparison to the other complexes studied (reaction rate to MNIC differs by a factor of 109). This is most likely related to the fact that not simply a second nitrogen monoxide molecule coordinates, but at the same time electron transfers take place and a conversion from {FeNO}7- to {Fe(NO)2}9-species occurs. In the study of the iron(II) complexes with the ligands bztpen and HPTB, it was shown that the reaction proceeds via an associative mechanism. In the case of the iron-HPTB complex, the activation parameters are in accordance with data from a similar complex in the literature. The activation of dioxygen by means of copper(I) complexes modelled on natural systems offers the possibility of replacing time-consuming or expensive synthetic routes by simple methods. The clip-and-cleave concept, which was already introduced by Becker et al., provide a pathway for a selective and intramolecular ligand hydroxylation. During these studies, this concept was examined and optimized by modifications on the ligand scaffold, changes in reaction conditions, and investigations of the hydroxylation mechanism. This investigation could show that even small changes on the ligand scaffold have a great influence on the reactivity of the complex and can lead to an increase, but also to a complete suppression of the hydroxylation reactivity. It was shown that hydroxylation of the different ligands (even with small differences) leads to the formation of different copper-dioxygen intermediates or even shows no intermediate at all despite successful ligand hydroxylation. Using cyclohexanecarbaldehyde as a substrate, it could be shown that in addition to the two known mechanisms for copper-mediated hydroxylation (via a bis(μ-oxido) or hydroperoxido complex), there is a third possibility for ligand hydroxylation starting from a copper(II) complex, which represents a promising, alternative and facile pathway for further oxygenation reactions. Hydroxylation of these substrates and also the various hydroxylation methods provide the opportunity for a stoichiometric and easy preparation of specialty chemicals or functionalization of difficult to access sites of substrates.
Adipozytokine als Bindeglied zwischen Metabolismus und arthritischen Veränderungen
(2019) Hülser, Marie-Lisa
Weltweit betrifft Adipositas und ihre Komorbiditäten immer mehr Menschen und gewinnt somit an klinischer, gesellschaftlicher und wirtschaftlicher Bedeutung. Adipozytokine sind bioaktive Faktoren, welche vor allem vom Fettgewebe produziert werden und die Energiehomöostase des Körpers regulieren. Da diese Adipozytokine durch Adipositas bzw. metabolische Veränderungen reguliert werden, können sie den Metabolismus mit dem Immunsystem verbinden, indem sie dieses modulieren. Nicht nur Adipositas, sondern auch Gelenkerkrankungen wie die degenerative Arthrose und die autoimmune Rheumatoide Arthritis sind weltweit verbreitet und so häuft sich die Zahl der Patienten, welche sowohl von Adipositas als auch von Gelenkerkrankungen betroffen sind. Um die Einflüsse von Übergewicht auf Arthritis und Arthrose genauer darzustellen wurden in dieser Dissertationsarbeit mehrere Mausmodelle kombiniert. Ein diätinduziertes Übergewicht wurde entweder mit einem Arthritismodell (Kollagen-induzierte Arthritis) oder einem Arthrosemodell (Destabilisierung der medialen Menisken) kombiniert. Durch Nekropsien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Arthritis- bzw. Arthroseinduktion sollte dargestellt werden, wie verschiedene Adipokine im Verlauf der Erkrankung exprimiert werden. Des Weiteren sollte zwischen systemischen Adipokinwerten im Serum und lokalen Adipokinverteilungen im Gelenk unterschieden werden.Das Arthrosemodell wurde in C57Bl/6 Mäusen durchgeführt, wobei den Tieren nach dreimonatiger Fütterung mit einer Standarddiät oder einer stark fetthaltigen Diät operativ die medialen Menisken durchtrennt wurden. 4, 6 und 8 Wochen nach Arthroseinduktion wurden dann die Gewebe entnommen und die Seren analysiert.Das Arthritismodell sollte zunächst zur optimalen Vergleichbarkeit im gleichen Mausstamm durchgeführt werden, hier konnte jedoch keine zufriedenstellende Inzidenz erreicht werden, sodass das Arthritismodell erfolgreich im DBA/1Rj Mausstamm durchgeführt wurde. Die Tiere wurden vor Beginn der Kollagen-induzierten Arthritis für 6 Wochen mit den gleichen Diäten gefüttert wie bereits die C57Bl/6 Mäuse und dann 4, 5,5 und 7 Wochen nach der ersten Immunisierung analysiert.Sowohl die metabolischen- als auch die Arthrose- und Arthritismodelle wurden erfolgreich durchgeführt. Die Gelenke der erkrankten Tiere wurden histologisch mittels eines etablierten Scores bemessen, um den Krankheitsverlauf darzustellen und mit metabolischen Parametern vergleichen zu können. Außerdem wurde der Metabolismus durch einen Score zur Darstellung der Leberverfettung charakterisiert und das Fettgewebe wurde auf Anzeichen einer Entzündung untersucht. Auch die Adipokine konnten im Serum gemessen und lokal histologisch dargestellt werden. Hierbei zeigte sich, dass Leptin stark durch die fetthaltige Diät erhöht, durch Arthroseinduktion jedoch nur leicht, und durch Arthritisinduktion sehr stark reduziert wird. Interessanterweise wurden Visfatin und Adiponektin systemisch deutlich weniger stark durch die Gelenkerkrankungen beeinflusst. Im Gelenk zeigte sich, dass in den geschädigten Bereichen deutlich mehr Adiponektin- und Leptin-produzierende Zellen vorhanden waren als in den entsprechenden gesunden Arealen. Die lokalen Adipokine waren unabhängig von den diätinduzierten systemisch-metabolischen Veränderungen.Diese Arbeit konnte außerdem zeigen, dass der Schweregrad der Arthrose vor allem mit dem Körpergewicht korreliert und weniger mit metabolischen Veränderungen, was auf einen ausgeprägten biomechanischen Einfluss hinweist.
Der adoptive zelluläre Gentransfer in einem Mausmodell der rheumatoiden Arthritis
(2010) Purath, Ulrich
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist durch chronische Entzündung des Synoviums und die daraus resultierende Zerstörung der Gelenkstruktur und -funktion charakterisiert. Der Einsatz von Biologika mit antientzündlicher Wirkung hat die Therapieoptionen für RA-Patienten erheblich verbessert. Durch Variation dieses Ansatzes sollte die Wirksamkeit weiter verbessert werden, indem sowohl eine veränderte Methode der Therapiegabe angewandt als auch verschiedene therapeutische Moleküle in Kombination verabreicht wurden. Der adoptive zelluläre Gentransfer (adoptive cellular gene transfer, ACGT) ist ein experimentelles Verfahren, welches genetisch modifizierte Zellen zum Transport therapeutisch wirksamer Gene an den Krankheitsherd und zur lokalen Expression dieser Gene einsetzt. Unreife dendritische Zellen (immature dendritic cells, iDC) sind hochmobile, den Organismus patrouillierende Zellen, die positiv chemotaktisch auf in Entzündungsgebieten ausgeschüttete Chemokine reagieren. Daher wurden iDC als Vehikelzellen eingesetzt, um die Gene für ein modifiziertes anti-TNFalpha-Antikörpermolekül (anti-TNF-single chain variable fragment, anti-TNF-scFv), die p40-Untereinheit von Interleukin-12 (IL-12 p40) und Galectin-1 (Gal-1) in entzündete Gelenke zu transportieren und lokal zu exprimieren. Die anti-inflammatorische Wirkung dieser Genprodukte sollte das Fortschreiten der Krankheit im Mausmodell der Kollagen-induzierten Arthritis (collagen-induced arthritis, CIA) lindern bzw. zur Remission führen. Beim Auftreten erster Symptome nach Induktion der CIA wurde die Therapie in Form einer Injektion der genetisch modifizierten iDC als Mono-, Zweifach- oder Dreifachkombination verabreicht. Verglichen mit den Monotherapien wurde eine schützende Wirkung der Kombinationstherapien in Bezug auf die Gelenkzerstörung beobachtet, die in hohem Maße von den kombinierten Genen abhängig war. Insgesamt zeigte die hier untersuchte Variante des ACGT als Therapie nur geringe Wirksamkeit. Die Auswertung der Daten und der Vergleich mit methodisch ähnlich gelagerten publizierten Arbeiten legt eine zu geringe Dosis der therapeutischen Genprodukte als Erklärung der niedrigen Wirksamkeit nahe.
Affordable diagnosis for Chagas disease
(2008) Hernández Pastor, Pilar
Chagas disease, caused by the flagellate Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America where it imposes a high burden on disability and death combined with enormous economic losses for up to 18 million people. Useful tests for the diagnosis of the disease are available, but they are too expensive to be used in in large scale in most of the affected countries. Furthermore, many diagnostic kits cannot clearly discriminate between Chagas disease and visceral leishmaniasis, which can be tolerated for immunological screening of samples in blood banks, but not for patients, since both diseases can occur in the same areas, however, need to be treated with different drugs. In addition, it is essential to recognise infection with T. cruzi in time, i.e. before the onset of severe clinical symptoms, since the available drugs are effective in the early stages of the disease only. This demands developing more specific and less expensive diagnostic tools. By means a bioinformatic approach, several recombinant antigens were produced, predominantly consisting of tandemly repeated amino acid sequences which occur in large numbers in different proteins of the parasite. Since the corresponding repeated DNA structures could not be maintained stably in E. coli, the whole range of possible base variations in codons was used to create varying coding sequences for up to nine tandem repeats of identical amino acid sequences. Some but not all of the expressed proteins were found to react strongly with sera from infected patients. To simplify purification as well as production, the most suitable antigens were fused. At the end a product composed of four different tandem repeat motives was obtained revealing an unexpected high diagnostic sensitivity, which was several orders of magnitude higher than with the antigens known so far. When used in ELISA, one milligram of the recombinant antigen is sufficient for one million single tests. Immunoassays can frequently not discriminate between acute infection and overcome disease. Therefore, two different PCR assays were developed in addition to determine the number of parasites circulating in blood after therapy with drugs. Targets of the one PCR assay are the more than 200 fold amplified genes for 18S rRNA and, for the other assay, the kinetoplast minicircle DNA which occurs in approximately 10.000 copies per parasite. Both of these test can detect as few as 10 trypanosomes per millilitre of blood and can clearly discriminate T. cruzi infections from infections with other Trypanosomatides. In conclusion, several highly sensitive and specific diagnostic procedures have been created, which are relatively simple to be performed and which can be produced for a low price. It is the goal to instruct scientist in Latin America to produce and to use these tests in the long term by their own means, independent of support from abroad.
Das Aggresom als molekulare Zielstruktur präventiver Wirkungen des Polyphenols Quercetin im Rahmen Glucose-induzierter Schädigungen im Nematoden Caenorhabditis elegans
(2019) Civelek, Mehtap
Weltweit nimmt die durchschnittliche Lebenserwartung und damit auch die Häufigkeit von altersbedingten Gesundheitsstörungen wie Diabetes mellitus Typ 2 zu. Diabetische Spätfolgen sind dabei die Konsequenz längerfristiger Hyperglykämien. Neben der akkuraten Kontrolle des Blutzuckers bzw. der konventionellen Therapie sind auch adjuvante Behandlungsmöglichkeiten, wie die Applikation sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, zu denen die Polyphenole zählen, von besonderem Interesse. Zur Gruppe der Polyphenole gehört auch das am besten untersuchte Flavonol Quercetin aus Äpfeln und Zwiebeln.Studien am Modellorganismus Caenorhabditis elegans (C. elegans) zeigten bereits, dass die Inkubation mit Glucose die Lebensspanne der Nematoden verkürzt. Als einer der hierfür verantwortlichen Mechanismen wurde in der mev-1-Mutante, die durch erhöhte Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffkonzentrationen (ROS) in den Mitochondrien gekennzeichnet ist, die Senkung der Aktivität des Proteasoms identifiziert. Durch zusätzliche Behandlung mit Quercetin konnte sowohl die Proteasomaktivität als auch die Überlebenszeit unter Hitzestress wieder auf den Wert der Kontrolle zurückgeführt werden, was mit einer Hemmung der Glucosetoxizität einhergeht. So war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des Aggresoms als potentielle Zielstruktur von Quercetin im Rahmen der Glucose-induzierten Schädigungen in der mev-1-Mutante zu erforschen.Bei dem sogenannten Aggresom handelt es sich um ein Einschlusskörperchen, das bei einer Überlastung oder Störung des Ubiquitin-Proteasom-Systems aus aggregierten Proteinen zusammengesetzt wird, um deren toxischen Einfluss auf die Zellfunktionen zunächst durch Speicherung und schließlich durch Elimination via Autophagie zu verhindern. An der Bildung von Aggresomen sind verschiedene Adaptorproteine wie ubql-1 oder sqst-1 beteiligt, welche die polyubiquitinierten Proteine mithilfe des Dyneinmotorkomplexes, dessen wichtiger Bestandteil dnc-1 ist, zunächst entlang der Mikrotubuli in die Nähe des Zellkerns transportieren.Nach dem mittels RNA-Interferenz (RNAi) erzielten Knockdown der Aggresom-relevanten Gene ubql-1 bzw. dnc-1 kam es zu einer Erhöhung der Proteinaggregation und einer Verkürzung der Überlebenszeit unter Hitzestress bei 37 °C. Unter RNAi der beiden Gene führte Glucose nicht zu einer weiteren Verkürzung der Überlebenszeit, wobei Quercetin diese unter Glucoseexposition auch nicht mehr verlängern konnte. Dies weist darauf hin, dass Glucose durch Hemmung und Quercetin durch Aktivierung dieser Aggresom-relevanten Gene die Stressresistenz und die Überlebenszeit von mev-1 gegenteilig beeinflussen. Der Knockdown von sqst-1 hingegen hatte trotz der Verringerung der Autophagie keinen Effekt auf die Überlebenszeit der Nematoden, die Verkürzung der Überlebenszeit durch Glucose oder die Verlängerung der Überlebenszeit durch Quercetin in Gegenwart von Glucose. Demnach wurde sqst-1 im Gegensatz zu ubql-1 und dnc-1 nicht als Zielgen von Glucose und Quercetin ermittelt. Aufgrund des Anstiegs der Proteasomaktivität unter sqst-1 RNAi konnte das Proteasom als kompensatorischer Mechanismus für die reduzierte Aggresombildung identifiziert werden.Da die Mitochondrien unter hyperglykämischen Bedingungen durch die vermehrte ROS-Produktion an diabetischen Spätfolgen beteiligt sind, wurde noch die spezifische Elimination dieser Organellen durch die Mitophagie untersucht. Unter RNAi von Mitophagie-relevanten Genen (dct-1, drp-1, eat-3, fis-1, fzo1, glb-1, pink-1 und pgam-5) kam es nicht nur zu einer Verkürzung der Überlebenszeit von mev-1 bei 37 °C, sondern auch zur Verringerung der Proteasomaktivität, der Autophagie und der Bildung von Lysosomen, wohingegen die mitochondrialen ROS-Spiegel und die Proteinaggregation zunahmen. Nur in funktioneller Abwesenheit von PDR-1 blieben trotz des Anstiegs der ROS-Konzentration die Überlebenszeit der Nematoden, die spezifische Aktivität des Proteasoms sowie die Proteinaggregation im Vergleich zur Kontrolle unverändert. Dies liegt offenbar an der kompensatorischen Induktion der Mitophagie im Falle des Knockdowns von pdr-1.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Zunahme der Proteinaggregation durch die Störung der Bestandteile des Proteostase-Netzwerkes die Überlebenszeit von C. elegans unter Stressbedingungen beim Fehlen von Kompensationsmechanismen beeinträchtigt. Diese fanden nur in funktioneller Abwesenheit von sqst-1 und pdr-1 statt. Somit besitzt neben der Degradation der Mitochondrien über Autophagosomen auch die Elimination von geschädigten Proteinen über die Aggresomen eine wesentliche Bedeutung für die Lebensspanne der Nematoden. Hierbei konnten in der mev-1-Mutante ubql-1 und dnc-1 als Aggresom-relevante Zielgene von Quercetin in Bezug auf die Verlängerung der Lebensspanne unter glucotoxischen Bedingungen identifiziert werden.
Aktivierung der Proteostase durch Quercetin als molekularer Mechanismus der Prävention Glukose-induzierter Schädigungen : Untersuchungen an der mev-1 Mutante des Nematoden Caenorhabditis elegans
(2016) Eisermann, Dorothe Jenni
Die chronische Hyperglykämie ist ein grundlegendes Charakteristikum des Diabetes mellitus. Sie gilt als Hauptursache für die Entstehung diabetischer Komplikationen und wird mit dem frühzeitigen Tod von Individuen assoziiert. Proteine vermitteln den Hauptteil zellulärer Funktionen und sind gleichzeitig die Makromoleküle mit der höchsten Sensitivität gegenüber zellulären Stresskonditionen aller Art. Die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase, der Proteostase, ist folglich unabdingbar für die Funktionalität der Zelle. Umgekehrt begünstigen Schädigungen von Elementen des Proteostase-Netzwerks die Pathogenese und Progression verschiedener Erkrankungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Stamm TK22 des Nematoden C. elegans als Modellorganismus herangezogen, um Glukose-induzierte Schädigungen sowie deren Prävention durch das Polyphenol Quercetin auf molekularer Ebene zu untersuchen.Die durch Glukose-induzierte Verkürzung der Überlebenszeit von TK22 konnte durch die zusätzliche Gabe von mikromolaren Quercetin-Konzentrationen verhindert werden. Um Proteostase-relevante Gene zu identifizieren, deren Funktionalität Voraussetzung für die präventive Wirkung des Quercetins ist, wurde die Expression entsprechender Gene mittels RNA-Interferenz (RNAi) vermindert. Dabei stellte sich heraus, dass die fehlende Aktivität von zentralen Genen der Unfolded Protein Response im Mitochondrium (UPRmt), wie hsp 60 und atfs-1, die Überlebenszeit von TK22 verkürzte und die Verlängerung der Überlebenszeit unter Glukoseexposition durch Quercetin verhinderte. Glukose führte zwar zu einer Stressantwort, wie anhand der Steigerung der Expression des Mitochondrien-spezifischen Chaperons hsp-60 gezeigt wurde. Diese reichte jedoch nicht aus um die Glukosetoxizität zu verhindern. Die RNAi des zentralen Transkriptionsfaktors XBP-1 der Unfolded Protein Response im ER (UPRER) führte ebenfalls zur Ineffektivität des Quercetins. Interessanterweise bewirkte die zusätzliche RNAi des für die Aktivierung von XBP-1 notwendigen Gens ire-1 keine zusätzliche Verkürzung der Überlebenszeit von mit xbp-1 RNAi behandelten Nematoden, sondern eine Verlängerung. Als ursächlich hierfür wurde die Aktivität der Proteinkinase PEK 1 identifiziert, die offenbar innerhalb eines zum IRE-1/XBP-1 parallelen Signalwegs dessen Ausfälle überkompensiert.Des Weiteren wurde die Bedeutung der beiden zentralen Abbauwege für geschädigte Proteine, der Autophagie und des proteasomalen Abbaus, im Hinblick auf die Glukosetoxizität verhindernden Effekte des Quercetins untersucht. Während die Effektivität des Quercetins durch eine Hemmung des Proteasoms mittels pbs-4 RNAi vollständig unterdrückt wurde, konnte die Glukosetoxizität durch Hemmung der Makroautophagie sowie der Chaperon-vermittelten Autophagie mittels RNAi von lgg-2 bzw. lmp-2 vollständig verhindert werden. Die Hemmung der Autophagie führte dabei zu einer Steigerung der proteasomalen Aktivität, die sich als essentiell für die Verhinderung der Glukosetoxizität erwies und auch als der durch Quercetin aktivierte Mechanismus identifiziert wurde. Auch die Kompensationsmechanismen unter ire-1 und xbp-1 Doppel-RNAi waren abhängig von einer erhöhten Proteasomaktivität und wurden durch die zusätzliche pek-1 RNAi verhindert. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Quercetin eine Glukosetoxizität in C. elegans TK22 in Abhängigkeit verschiedener Faktoren der UPR vollständig verhindert. Sowohl Quercetin, als auch die Hemmung zentraler Elemente der UPR und der Autophagie resultierten in einer Aktivierung des Proteasoms, das dementsprechend als entscheidendes zu aktivierendes Element im Hinblick auf die Prävention durch Glukose verursachter Schädigungen identifiziert werden konnte.
Aktivierung von Hämozyten des Tabakschwärmers Manduca sexta nach bakteriellen Infektionen
(2002) Scholz, Frank-Rüdiger
Hämozyten sind bei Insekten an Abwehrreaktionen, wie z. B. Neusynthese und Sekretion verschiedener antimikrobieller Substanzen,Phagozytose und Einkapselung beteiligt. Bisher gibt es nur wenige Erkenntnisse über die bei einer zellulären Abwehr beteiligten Moleküleund Mechanismen. Zwei unterschiedliche methodische Ansätze, proteinchemisch und molekularbiologisch, wurden zum Nachweis an Aktivierungsvorgängenvon Hämozyten beteiligter Moleküle genutzt. Proteinchemisch konnten mehrere Proteine mit Affinität zu Lipopolysaccharid (LPS)identifiziert werden. Zwei Proteine von ca. 21 kDa wurden gereinigt und N-terminal sequenziert. Molekularbiologisch gelang die Klonierung von 4 cDNAs, aus zuvor produzierten Expressionsbibliotheken des Fettkörpers und ausHämozyten. Aufgrund der festgestellten Sequenzhomologien und der ersten Ergebnisse zur biochemischen Charakterisierung ist davonauszugehen, dass die von diesen cDNAs kodierten Proteine eine Funktion in der Hämozytenaktivierung besitzen. Das Hämozyten-Aggregation-inhibierende Protein (HAIP) zeigt eine Sequenzhomologie zu Chitinase-verwandten Wachstumsfaktoren. DieRNA ist im Fettkörper nachweisbar, Hämozyten enthalten sie nicht. Bakterielle Infektion führt nicht zu einer gesteigerten Expression vonHAIP. Immunhistochemisch konnte HAIP in Hämozyten nachgewiesen werden. Daneben wurde gezeigt, dass HAIP Chitin bindet. Chitosanund Xylose können diese Bindung teilweise antagonisieren. Immunolektin-3 (IML-3) zeigt eine Sequenzhomologie zu verschiedenenCalcium-abhängigen Lektinen. Die IML-3-RNA ist im Fettkörper nachweisbar, wo seine Expression durch bakterielle Infektionen induziertwird. Hämozyten enthalten keine IML-3-RNA. In der Hämolymphe sind mit dem gegen das rekombinante Protein hergestellten Antikörperdrei Proteine detektierbar. Nach bakteriellen Infektionen ist IML-3 in Plasmatozyten, neben granulären Zellen wichtigsten phagozytierendenZellen, nachweisbar. Ferner konnten erste Anhaltspunkte für eine Assoziation von IML-3 mit sich selbst oder anderen Hämolymphkomponenten gefunden werden. Fettkörper-Protease-1 (FP-1) zeigt eine Sequenzhomologie zu CLIP-Domänen Proteasen.FP--1 wird von Hämozyten und Fettkörper exprimiert, im Fettkörper ist die Expression induzierbar. In Infektionsexperimenten konnte eineAktivierung der FP-1 nach Injektion Gram-positiver Bakterien beobachtet werden. Darüber hinaus konnte das Protein in Oenozytoiden, denProphenoloxidase synthetisierenden Zellen, nachgewiesen werden. Die vollständige cDNA des M. sexta Hemocytin (MsHc) wurde kloniertund analysiert. Das kodierte Protein ist homolog zum von-Willebrand Faktor. Die RNA des MsHc ist in Hämozyten nachweisbar,bakterieller Infektionen führen nicht zu einer Induktion.
Alpha-Aminosulfonsäuren : Synthese und Anwendung in der Organokatalyse
(2008) Duncker, Samuel
Erstmals wurden alpha-Aminosulfonsäuren als Katalysatoren eingesetzt. Es wurde gezeigt dass racemische Pyrrolidin-2-sulfonsäure, ein Analogon des Prolins, die Aldolreaktion zwischen p-Nitrobenzaldehyd und einer Reihe von Ketonen in wässrigen, gepufferten Lösungen katalysiert. Auch die katalytische Wirkung einer Reihe von offenkettigen alpha-Aminosulfonsäuren sowie der Einfluss des pH-Wertes wurden untersucht. Anschließend wurde auf verschiedenen Wegen versucht, enantiomerenreine alpha-Aminosulfonsäuren zu synthetisieren. Durch die Sulfonierung von ein- oder zweifach substituierten, enantiomerenreinen 3,4-Dihydro-2H-pyrrolen wurden Diastereomerenpaare von cyclischen alpha-Aminosulfonsäuren gewonnen. Die Anreicherung eines sterisch begünstigten Diastereomeren im Gleichgewicht und damit die bedingte konfigurative Stabilität einer solchen alpha-Aminosulfonsäure konnte im NMR-Spektrum beobachtet werden. Die mit dieser Verbindung katalysierte Aldolreaktion lieferte racemisches Aldolprodukt. Auch aus der Sulfonierung von den Iminen enantiomerenreiner Aldehyde gewonnene alpha-Aminosulfonsäuren katalysierten die Aldolreaktion unter Bildung racemischen Aldolprodukts. Eine weitere Reihe von alpha-Aminosulfonsäuren wurde durch die Sulfonierung von Iminen enantiomerenreinen substituierten Cyclohexylamins sowie enantiomerenreinen Cyclohexyl-1,2-diamins mit Benzaldehyd gewonnen. Mit diesen alpha-Aminosulfonsäuren wurden in der katalysierten Aldolreaktion von p-Nitrobenzaldehyd mit Aceton Enantiomerenüberschüsse von bis zu 31 % erreicht.
Alternative splicing regulation in the human system : mechanistic studies of hnRNP L and CA-rich elements
(2008) Heiner, Monika
Alternative splicing of pre-mRNAs is the major contributor in the human system to generate complex proteomes from a comparatively low number of genes. Several modes of alternative splicing are known today which are tightly regulated to ensure accurate protein expression. We have identified intronic CA repeat and CA-rich sequences as a new class of regulatory elements acting as enhancers or silencers on alternative splicing. Their function is mediated by the heterogenous ribonucleoprotein (hnRNP) L which has been characterised as the main CA binding protein. Considering that CA repetitive sequences are very common in the human genome, the identification and analysis of hnRNP L target genes should give further insights into the mechanism of alternative splicing regulation. In this work, I studied alternative splicing regulation of three recently identified hnRNP L target genes. First, in the SLC2A2 gene CA repeats were identified as an intronic splicing silencer element. Their function was shown to depend on hnRNP L as the trans-acting factor. Further studies on the mechanism of splicing regulation demonstrated that hnRNP L interfered with 5 splice site recognition by the U1 snRNP. Second, I characterised a short intronic CA-rich cluster in the TJP1 gene as an hnRNP L-dependent splicing silencer. In contrast to SLC2A2, hnRNP L was shown to compete with U2AF65 for binding to the polypyrimidine tract thus impairing 3 splice site recognition. Third, an intronic CA repeat in the ITGA2 gene either activated splicing of the corresponding exon or repressed recognition of a cryptic exon in a sequence-dependent manner. Furthermore, a combined microarray and RNAi analysis revealed new modes of hnRNP L-mediated splicing regulation and, moreover, a novel role for hnRNP L in alternative polyadenylation. In the ASAH1 gene, hnRNP L repressed usage of an internal poly(A) site. Taken together, I have studied different mechanism of splicing regulation on the basis of three genes, SLC2A2, TJP1, and ITGA2. The results revealed new functions of CA repeat and CA-rich sequences and hnRNP L in alternative splicing regulation. In sum, hnRNP L was shown to be a global and versatile regulator protein in the human system with roles in alterative splicing and polyadenylation.
Altersabhängigkeit von Lipidperoxidation, Proteinoxidation und proteasomalem Abbau oxidierter Proteine
(2010) Arndt, Jana
In der vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen bearbeitet werden:- Gibt es bei der Alterung verschiedener Organe eine verstärkte LPO und PO?- Wie ändert sich die Aktivität des proteasomalen Systems der Beseitigung oxidativmodifizierter Proteine altersabhängig in den untersuchten Organen?- Korreliert die altersabhängige Veränderung der Aktivität des Proteasoms alsBestandteil der sekundären antioxidativen Schutzsysteme mit der altersabhängigenAnhäufung oxidativ modifizierter Proteine generell oder in einzelnen Organen?Für die Bewertung der LPO wurde MDA als Parameter gewählt und mittels HPLC analysiert.Des Weiteren wurden für die PO in den untersuchten Organen die Protein-Carbonyle mittelsELISA gemessen und zusätzlich die Kapazität des 20S-Proteasoms mittels Fluorometrie. AlleUntersuchungen wurden an Wistar-Ratten folgenden Alters vorgenommen: 6, 10, 18 und 26Monate (je Gruppe n von 5 bis 7). Die normale Verteilung der Daten wurde mit dem Onesample Kolmogorov-Smirnov-Test bewertet. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe derStatistiksoftware SPSS (15.0) durchgeführt.Die MDA- und die Protein-Carbonyl-Konzentrationen stiegen in allen Organen spätestens abdem 18. Monat im Vergleich zum 6. und auch zum 10. Monat an. Weitere Veränderungen inder 4. Altersgruppe waren nicht signifikant. Die Aktivität des Proteasoms fiel insgesamt ab.Signifikante Verringerungen zeigten sich in Lunge und Leber. Die Proteasomenaktivität indiesen beiden Organen verringerte sich um den Faktor fünf. Strenge Korrelationen zwischenProteasomaktivität und Proteinoxidation wurden ebenfalls in Leber und Lunge gefunden,während in den anderen Organen nur ein solcher Trend sichtbar wurde. Die Resultate zeigen,dass der Anstieg der Proteinoxidation und der Abfall der Proteasomenaktivität korrelieren.Der Abfall des proteasomalen Abbaus allein kann die gemessene Akkumulationsrate derProtein-Carbonyle nicht erklären. Somit sind sowohl der altersabhängige Abfall derproteasomalen Aktivität als auch die erhöhte Bildungsrate oxidativ veränderter Proteine amAnstieg der Protein-Carbonyle beteiligt.Sowohl LPO als auch Proteinoxidation tragen maßgeblich zur Alterung bei und zwar durchvermehrte direkte Bildung der LPO- und PO-Produkte als auch durch deren verminderteBeseitigung. Maßnahmen zur Erhaltung der Aktivität des Proteasoms im höheren Lebensalterkönnten die Alterungsprozesse verzögern.
Analyse der biologischen Funktionen von Sirt6 in metabolischen Prozessen
(2012) Smolka, Christian
Sirtuine umfassen eine hoch konservierte Protein Familie, die eine NAD+-abhängige Deacetylasefunktion und/oder eine ADP-Ribosyltransferaseaktivität aufweisen. In S. cerevisiae und C. elegans konnte gezeigt werden, das Sirtuine die lebensverlängernden Effekte der kalorischen Restriktion vermitteln und dadurch den Prozess des Alterns regulieren. In zahlreichen Studien konnte belegt werden, dass Sirtuine mit vielen Proteinen assoziieren, die in Prozesse involviert sind, die das Leben eines Organismus steuern. Dazu gehören: die Entwicklung, Differenzierung, Seneszenz, Proliferation, sowie die metabolische Regulation. In der vorliegenden Arbeit wurde eine in vitro und in vivo Charakterisierung von Sirt6 durchgeführt, die neue Einblicke in die Funktion von Sirt6 liefern sollte. Der homozygote konstitutive Knock Out von Sirt6 führt in Mäusen zu einem frühzeitigen Tod innerhalb der ersten drei Lebenswochen und erlaubt somit keine Untersuchung der Sirt6 Funktion in adulten Tieren. Durch die Herstellung genetisch veränderter Mäuse, die eine konditionelle Deletion von Sirt6 erlauben, wurde in dieser Arbeit die Voraussetzung zur Analyse der biologischen Funktion von Sirt6 im lebenden adulten Organismus geschaffen. Die zur Kontrolle hergestellte Nullmutation resultierte dabei in demselben Phänotyp, wie er bereits für das konstitutive Knock Out Allel beschrieben ist. Mäuse mit einer leberspezifischen Deletion von Sirt6 zeigten zunächst keine phänotypischen Auffälligkeiten, entwickelten aber mit zunehmendem Alter eine Insulinresistenz und zeigten degenerative Veränderungen in der Leber. Diese Beobachtungen unterstreichen die Funktion von Sirt6 als Regulator metabolischer Prozesse. Neben der Generierung der konditionellen Sirt6 Maus wurde ein SILAC basiertes Screening nach Interaktionspartnern der Sirtuine Sirt1, Sirt6 und Sirt7 durchgeführt. Durch das Screening konnten bereits bekannte sowie viele unbekannte potentielle Bindungspartner identifiziert werden, die zum Teil auch Überlappungen zwischen den Sirtuinen aufwiesen. Durch Co-Immunopräzipitationen konnten einige der möglichen Interaktionspartner von Sirt6 bestätigt werden, darunter auch Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase 1 (GFAT1). GFAT1 ist das Schlüsselenzym des Hexosamin-Biosyntheseweges (HBW). Das Endprodukt des HBW ist UDP-N-Acetylglucosamin, ein Zuckerrest der reversibel und spezifisch an Serin und Threonin gebunden wird und dadurch die Eigenschaften betroffener Proteine verändert. Der HBW funktioniert als Negativregulator der Insulinsignalkaskade und viele Studien belegen, dass eine erhöhte chronische Aktivität des HBW zur Entstehung von Diabetes beiträgt. In der Leber Sirt6 defizienter Tiere konnte in diesem Zusammenhang eine gesteigerte GFAT1 Aktivität gemessen, sowie eine erhöhte globale Protein-O-Glykosylierung detektiert werden. Die Validierung anderer Bindungspartner von Sirt6 deutet an, dass Sirt6 in Prozesse die die Stabilität und den Abbau von mRNA sowie deren Translation steuern und zudem in die Regulation der Stressantwort involviert ist.
Analyse der dreidimensionalen Anordnung genomischer Isolatoren in Drosophila melanogaster
(2016) Buxa, Melanie Karin
Kürzlich wurden die zwei Isolatorproteine PITA und ZIPIC neu identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit lieferten Immunfluoreszenz-Analysen von Drosophila Polytänchromosomen eine visuelle Darstellung der genomweiten Verteilung von PITA und ZIPIC an typischen Isolatorpositionen, den Banden/ Interbanden-Grenzen sowie eine Protein-Protein-Interaktionen mit CP190. Die Befunde der Kolokalisation der Isolatorproteine mit CP190 belegen, dass CP190 eine gemeinsame Funktion aller Isolatorproteine vermittelt. Diese Kolokalisation wirkt sich auf die Chromatin-Konformation aus. Um den möglichen molekularen Mechanismus hinter dieser Beobachtung genauer zu untersuchen, wurden Funktionstest (RNAi Screen) und massenspektrometrische Analysen durchgeführt (Bohla et al., 2014). Die in dieser Arbeit durchgeführten Co-Immunpräzipitationen verifizierten diese zuvor erzielten Ergebnisse, dass Komponenten des NURF und dREAM Komplexes Interaktionspartner von dCTCF und CP190 sind.Isolatorproteinen wird die architektonische Funktion zugeschrieben, dass sie Chromatin-Chromatin-Interaktionen über große Distanzen vermitteln. Sie kolokalisieren innerhalb des Zellkerns und bilden Strukturen, die als Isolator bodies bezeichnet werden. Isolator bodies sind nicht an Isolation (und auch nicht an Chromatin-Chromatin-Interaktionen) beteiligt. Im Gegensatz dazu ist für die filigraneren Isolator speckles nicht bekannt, inwieweit diese am Phänomen der Isolation involviert sind. Für Polycomb bodies wird postuliert, dass sie long-distance Interaktionen der Hox-Gencluster Antennapedia Komplex (ANT-C) und Bithorax Komplex (BX-C) von Drosophila vermitteln. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eher Isolatorproteine als PcG-Komplexe an der long-range Organisation von PcG regulierten Genen innerhalb des Zellkerns mitwirken.In der vorliegenden Arbeit wurden hochauflösende 3-dimensionale Analysen von Isolatorproteinen durchgeführt, welche dCTCF Isolator speckles und Polycomb bodies als unterschiedliche Strukturen innerhalb der Interphase-Zellkerne von Drosophila melanogaster identifizieren konnten. Diese Strukturen unterscheiden sich sowohl in ihrer Anzahl als auch in ihrer räumlichen Anordnung. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit lag darin, den Abstand von Isolator speckles relativ zu long-range Interaktionen zu messen, um einen möglichen Zusammenhang zwischen Isolator speckles und long-range Chromatin-Interaktion zu finden. Unter Verwendung von DNA FISH und Sonden gegen die Hox-Gencluster konnten sowohl Hox gene kissing Ereignisse identifiziert werden, als auch, durch eine Kombination von DNA FISH und dCTCF-Immunfluoreszenz, die Distanz zwischen dCTCF speckles und dem Sondenpaar bestimmt werden. Die Auswertungen der Structured Illumination Microscopy (SIM) Aufnahmen ergaben, dass die Distanzen zwischen dCTCF speckles und kissing Sondenpaaren signifikant kürzer waren als in nicht-interagierenden Fällen, was dafür spricht, dass ein Zusammenhang zwischen Isolator speckles und long-range Chromatin-Interaktionen besteht. Man kann deshalb annehmen, dass Isolator speckles mit long-distance Chromatin-Kontakten assoziiert sind.
Analyse der genetischen Diversität von wildwachsenden Futterpflanzen aus der Sahelzone in Westafrika anhand von RAPD - Markern
(1999) Langsdorf, Andreas
Brachiaria and Zornia belong to the most important wild forage plants in the Sahel region of West Africa. Due to their heat- and aridity resistance they are welladapted to extreme climate and able to overcome great deviations in precipitation during the rainy season. Extensive agriculture and overstocking are destroying huge parts of the productive landscape in the Sahel (shortage of forage plants). These regions aregenerally not very suitable for agriculture, so the millet fields are given up after a few years. This is followed by an increase in desertification processes. Due tothe great importance of these forage plants, both to the local agricultural economy and also in plant breeding, an international project for their comprehensiveanalysis has been established. The main target is to build an initial database for further projects, i.e. the establishment of guidelines for in situ conservation. The work presented here is an investigation of the genetic diversity of Brachiaria and Zornia over a study area of about 2000 km2. Plant samples werecollected in several years at 34 test sites and analysed using RAPD-markers. For Brachiaria, 309 samples from 25 locations were analysed with 10 primers. A few samples were analysed morphologically (Prof. Scholz, FU Berlin) andfive species of Brachiaria could be determined (B. xantholeuca, B. nidulans, B. orthostachys, B. ramosa, B. lata). Using the RAPD method the same samplescould be discriminated into five groups by cluster analysis. A 100 % correspondence between morphological and molecular genetic analysis was observed,whereby a characterisation of these five species of Brachiaria was possible. The five species showed a high genetic diversity and most of the study sites couldbe discriminated using RAPD markers. For some locations a differentiation of the two or three collection years was observed, introducing the term 'temporalgenotypes'. For B. xantholeuca, the genetic similarity at test sites within a radius of 50 km enabled their combination into ecotypes. B. xantholeuca therefore exhibits a highregional homogeneity, while B. nidulans and B. orthostachys are more location specific. 80 samples from Zornio glochidiata were analysed using six primers. The genetic variability was high showing a huge inter-individual heterogeneity. For thatreason a differentiation neither of test sites nor the three collecting years was possible. More extensive molecular genetic investigation is necessary to gain a better understanding of the regional and temporal effects in wild forage plants. Ofparticular interest will be RAPD analyses of the forage plants Alysicarpus, Dactyloctenium and Cenchrus.
Analyse der Interaktion von microRNA-122-Protein-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-untranslatierten Region der Hepatitis C Virus-RNA
(2016) Dünnes, Nadia
Das Hepatitis C Virus besitzt ein einzelsträngiges, positiv orientiertes RNA-Genom und ist der Familie der Flaviviridae zugeordnet. Aufgrund der positiven Orientierung kann das Genom nach der Infektion von Hepatozyten direkt dem Translationsapparat der Zelle zur Verfügung gestellt werden. Das 9600 Nukleotide umfassende Genom besitzt einen offenen Leserahmen (ORF), welcher für ein einziges Polyprotein kodiert. Nach erfolgter co- und posttranslationaler Prozessierung entstehen die reifen Genprodukte. Flankiert wird der ORF von zwei untranslatierten Regionen (UTRs), der 5´- und der 3´-UTR, welche die cis-Signale für die Translation und Replikation der viralen RNA beinhalten. Die 5´-UTR bildet eine hochkonservierte Sekundärstruktur aus, die sogenannte interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche eine cap-unabhängige Translation ermöglicht. Weiterhin besitzt die HCV-RNA verschiedene Erkennungssequenzen für die leberspezifische microRNA-122 (miR-122). Zwei dieser hochkonservierten Sequenzen befinden sich in der 5´-UTR, welche durch eine Adressierung der miR-122, gebunden an das Argonaute2-Protein (Ago2), zu einer Verstärkung der RNA-Replikation und Translation so wie zu einer Stabilisierung der RNA führt. Eine weitere miR-122-Bindungsstelle befindet sich in der variablen Region der 3´-UTR, von der berichtet wird, dass eine miR-122-Bindung keinen Einfluss auf die Translation hat. Außerdem befinden sich noch zwei hochkonservierte Erkennungssequenzen in der Nicht-Struktur-Protein 5B (NS5B)-kodierenden Region des HCV-Genoms.Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von miR-122/Ago2-Komplexen mit der NS5B-kodierenden Region und der 3´-UTR der Hepatitis C Virus-RNA. Es konnte durch co-Immunopräzipitationen gezeigt werden, dass der miR-122/Ago2-Komplex an die drei Erkennungssequenzen in der NS5B-Region und der 3´-UTR hybridisiert. Die Stärke der Bindung hängt jedoch sowohl vom verwendeten Genotypen ab, als auch davon, wie zugänglich die jeweilige Erkennungssequenz für den Komplex vorliegt. Zusätzlich konnte noch die in der Arbeitsgruppe Niepmann aufgestellte Theorie, dass eine Bindung der miR-122 an ihre seed-target-Sequenz in der 3´-UTR der HCV-RNA nur in Kombination mit einer zusätzlichen 4 Nukleotide langen Sequenz (supplemental-Region) möglich ist, widerlegt werden. Für eine Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR genügt die seed-target Sequenz. Außerdem konnte die Bindung durch das Einbringen von Mutationen in allen drei Erkennungssequenzen unterbunden werden. Des Weiteren konnte durch die Verwendung von HCV-Reporter-Konstrukten gezeigt werden, dass die Hybridisierung des miR-122/Ago2-Komplexes an die 3´-UTR zu einer Reduktion der Translation führt, dies jedoch nur in Kombination mit einer miR-122-Bindung an die 5´-UTR. Diese Ergebnisse sind Voraussetzung für die weitergehende Untersuchung der Rolle dieser miR-122-Bindungsstellen im HCV-Replikationszyklus.
Analyse der morphologischen und physiologischen Differenzierung in Sorangium cellulosum So ce56 : Lon-Proteasen und Stickstoffmetabolismus
(2007) Doß, Sabrina Désirée
Die komplexe Lebensweise von Sorangium cellulosum So ce56 in Form eines vegetativen Lebenszyklus sowie der Fähigkeit zur multizellulären Differenzierung wirft unweigerlich die Frage auf, welche Signale für die Entscheidung zwischen vegetativem Wachstum und Differenzierung verantwortlich sind. Die vorliegende Arbeit sollte zur Charakterisierung der morphologischen Differenzierung in So ce56 und beteiligter Proteine beitragen. Für die Charakterisierung der morphologischen Differenzierung von So ce56 war zunächst die Etablierung eines geeigneten Nährstoffmangelmediums notwendig. Ferner wurden für die weitere Untersuchung der Differenzierung Mutanten konstruiert, die einen Defekt in der Differenzierung aufwiesen. Im Laufe der Arbeit verschob sich der Schwerpunkt auf die Beteiligung der Lon-Proteasen im Stickstoffmetabolismus von So ce56 und deren spezifischer Substrate. Die Ergebnisse der Arbeit zeigten, dass die Differenzierung von So ce56 von einer drastischen Reduzierung der Nährstoffe sowie von einer bestimmten Zelldichte abhängig ist. Höhere Nährstoffkonzentrationen sowie eine geringere Zelldichte konnten die Differenzierung von So ce56 nicht initiieren. Zur weiteren Untersuchung der Differenzierung von So ce56 wurden differenzierungsdefekte Mutanten konstruiert. Analysen des Genoms von So ce56 ergaben Übereinstimmungen zu den aus Myxococcus xanthus bekannten und für die Differenzierung notwendigen Genen asgA und bsgA (= lonD). Es wurden ein asgA-homologes und fünf lon-homologe Gene identifiziert. Anhand von Expressionsstudien wurde für das asgA-Gen von So ce56 gezeigt, dass dessen Expression positiv unter Differenzierungsbedingungen reguliert wird. Weiterhin zeigte sich durch Expressionsstudien, dass die asgA-Expression abhängig von der stringenten Kontrolle ist. Für die Expression der Gene lon1-4 wurde unter Differenzierungsbedingungen eine negative Regulation der Expression ermittelt, wohingegen lon5 konstitutiv exprimiert wird. Morphologische Differenzierungsstudien der entsprechenden Mutanten ergaben, dass alle einen Defekt in der Differenzierung aufwiesen und die entsprechenden Genprodukte in der Differenzierung von So ce56 beteiligt sind. Untersuchungen dieser differenzierungsdefekten Mutanten hinsichtlich der Produktion der Sekundärmetabolite ergaben, dass Lon2 in der Chivosazol-Biosynthese und Lon4 in der Etnangien-Biosynthese involviert sind. Im Verlauf der Untersuchungen wurden potenzielle Substrate der Lon-Proteasen Lon1 und Lon2 identifiziert, die allesamt im Stickstoffmetabolismus bekannter Bakterien, wie z. B. E. coli oder S. elongatus, involviert sind. Unter anderem konnte das PII-Protein (GlnB) als potenzielles spezifisches Substrat der Lon2-Protease ermittelt werden. Analysen der Aminosäuresequenz von GlnB aus So ce56 ergaben, dass sowohl der für die Uridylylierung in E. coli wichtige Aminosäurerest Tyr51 als auch der für die Phosphorylierung in Cyanobakterien wichtige Aminosäurerest Ser49 in So ce56 vorhanden sind. Genauere Untersuchungen der PII-Modifikationen in So ce56 ergaben eine Modifikation in Form einer Phosphorylierung des PII-Proteins, womit die Modifikation der in Cyanobakterien gleicht. Durch die Identifizierung stickstoffregulierter Proteine als mögliche Substrate der Lon-Proteasen konnten erste Hinweise auf eine Beteiligung der Lon-Proteasen am Stickstoffmetabolismus gefunden werden. Vergleichende Wachstumsstudien mit den zwei untersuchten lon-Mutanten Slon1 und Slon2 mit viel und wenig Stickstoff zeigten einen Wachstumsdefekt unter Stickstofflimitierung. Die gesammelten Ergebnisse lassen vermuten, dass die Lon-Proteasen entweder direkt über das mögliche Substrat oder aber indirekt in den Stickstoffmetabolismus von So ce56 involviert sind.
Analyse der posttranslationalen Modifikationen von Proteinen in den Mikrofilarienscheiden von Litomosoides sigmodontis
(2000) Kasper, Martin
Filariosen sind weit verbreitete Erkrankungen bei Mensch und Tier in den Tropen. Nach Schätzungen der WHO sind derzeit etwa 400 Mio.Menschen infiziert [1]. Auslöser dieser Krankheit sind Nematoden wie Wuchereria bancrofti und Brugia-Arten, die für ihre VermehrungArthropoden als Vektoren benutzen. Zur Untersuchung der Filariosen und ihrer Pathogenese im Labor hat sich Litomosoides sigmodontis als Tierfilarien-Art in einem gutcharakterisierten Wirtstiermodell bewährt (Nager: Sigmodon hispidus). Trotz sehr komplexer immunologischer Beobachtungen während des Krankheitsverlaufs beim mit Litomosoides infizierten Wirt, ist jedochganz allgemein ein Rückgang der Immunreaktion gegenüber deren Larven, den Mikrofilarien, charakteristisch. Diese sind allseitig voneiner Hülle, der Scheide, umgeben, die sie in bislang ungeklärter Weise vor Angriffen des Wirts-Immunsystems schützt. Untersuchungen ananderen Nematodenfamilien deuten auf verschiedene Evasionsmechanismen der Erreger hin, wie z.B. molekulare Mimikry oderchemische Modifikation der Filarienenoberfläche, welche eine modulierende Wirkung auf das Wirts-Immunsystem ausüben. Daher ist diebiochemische Analyse der L. sigmodontis- Mikrofilarienscheide zum besseren Verständnis der molekularen Vorgänge bei derImmunevasion von großer Bedeutung. In der Mikrofilarienscheide von L. sigmodontis sind selektiv die beiden Oberflächen-Polypeptide shp3 und shp3a hochgradigposttranslational mit dem biogenen Amin Dimethylaminoethanol (DMAE) modifiziert [2], welches antidepressive Eigenschaften besitzt. Mit Hilfe der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) wurde die Struktur von DMAE als das Fmoc-Derivat ausführlichbeschrieben. Insbesondere weist shp3a massenspektrometrisch, per MALDI-TOF-MS, einen Modifikationsanteil von 75% seinerGesamtmasse auf, bzw. 25% DMAE. Eine Dephosphorylierung mit HF ergab einen Massenverlust von ca. 18 kDa, was 110Phospho-DMAE-Resten entspricht. Die Modifizierung mit DMAE ist derart charakteristisch, dass es analytisch zur Differenzierung vonanderen Scheidenpolypeptiden als Marker dienen kann. Die DMAE-Homologen Cholin und Monomethylaminoethanol (MMAE) wurdenlediglich in Spuren detektiert. Des weiteren lassen sich shp3 und shp3a, im Gegensatz zu anderen Scheidenproteinen, in der SDS-PAGEmit Stains-All® individuell färben, was auf polyanionische Eigenschaften hinweist [3]. Das Ergebnis der Bausteinanalysen in den L. sigmodontis-Mikrofilarienscheiden weist mit ca. 6% N-Acetylgalaktosamin, 3% Galaktoseund 0.2% Uronsäuren ausschließlich auf O-glykosidisch gebundene Kohlenhydrate hin [4,5]. Zur Untersuchung der Glykosylierung wurdendie Kohlenhydrate durch Hydrazinolyse sowie reduktive [beta]-Eliminierung freigesetzt. Die massenspektrometrische Analyse ergabmonomeres N-Acetylgalaktosamin und das Disaccharid Gal1-3GalNAc. Zum Unterschied zu gewöhnlichen O-Glykanen sind sie nicht, wieallgemein beobachtet, durch Sialinsäuren, Fucose oder Sulfat terminiert und ähneln dem sog. Tn- bzw. T-Antigen. In Kombination mitMALDI-TOF-MS ergab die Methylierungsanalyse mittels GC/MS ein Trisaccharid mit der ungewöhnlichen Sequenz Gal1-3-Gal1-3-GalNAc.Darüber-hinaus haben vergleichende Analysen vor und nach HF-Behandlung ergeben, dass sieben OH-Gruppen des Trisaccharids mitPhospho-DMAE verestert sind, von denen vier auf der terminalen Galaktose lokalisiert wurden; die drei restlichen Positionen sind nichteindeutig zuordenbar. Durch die chemische Synthese von an Rinderinsulin und -serumalbumin gekoppeltem Phospho-DMAE als Hapten standen Produkte für dieGewinnung von Antikörpern sowie für den Einsatz in histochemischen Experimenten zur Verfügung.

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